不同DNA晕环:大晕环,中晕环,小晕环,无晕环及退化精子操作步骤:严格按照Halosperm试剂盒说明书操作把标本渗入琼脂凝胶取出裂解液至于室温放置(22℃)。使用精子洗液将精液样本稀释至5×106-10×106/ml。确保精子悬液的浓度不要过大。将试剂盒中的琼脂糖凝胶管至于100℃的水浴中5min直到琼脂糖溶解。琼脂糖凝胶也可至于微波炉中溶解。将溶解后的琼脂糖凝胶管至于37℃的水浴中5min,直到其温度降至37℃。将25μl的稀释后的精液悬液加入琼脂糖凝胶管中混合。从琼脂糖凝胶管中取20μl精子悬液至于载玻片上,覆盖22×22mm的盖玻片。整个过程中小心操作避免产生气泡。将预处理好的玻片至于冰箱4℃的冷藏室内5min,以使琼脂糖凝胶凝固。准备酸变性液。取80μl的酸变性液稀释于10ml的生理盐水中,混合后备用。.1.8小心滑拉取开盖玻片,尽快放入变性液中保存水平浸在变性液中孵育7min。.1.9带上手套用刀片辅助把玻片水平取出,将玻片保持水平放入裂解液中裂解25分钟。.1.10取出玻片水平放入装有一定量蒸馏水的托盘中5分钟,这一步师是为了洗掉裂解液。11广州医学院硕士学位论文.1.11然后将玻片分别放入70%,90%和100%乙醇中各2分钟;.1.12让玻片自然晾干,晾干的玻片可以放入保存盒在室温条件下保存数月。标本的染色与计数使用瑞士染液给标本染色,先使用染液A液完全覆盖在标本上30s,再使用染液B液覆盖在标本上2min,然后将标本放置在水龙头下轻轻冲洗干净后晾干。待标本自然晾干后将标本置于显微镜下进行计数,计算每1000个精子中有DNA缺损的精子个数,需注意避免在琼脂边缘计数精子数目。4.统计学分析采用统计软件SPSS18.0进行统计学分析,所测定的各项指标数据均为正态分布,采用`X±S表示。三种处理方法的比较采用单因素的方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。12
全文预览
