的巨噬细胞提取RNA。?测试基因共两个:为IL-6(NM_031168),内参基因GAPDH(NM_008084)。Р三:实验内容Р细胞RNA抽提?RNA反转录?定量PCR检测?数据分析Р四:实验主要仪器和试剂Р主要实验仪器?冷冻超速离心机?常规PCR仪?酶标仪?电泳系统?CFX96 Real Time PCR SystemР四:实验主要仪器和试剂Р主要实验试剂?RIzol(Invitrogen)、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水?TaKaRa KitsР五:实验操作Р前期准备?为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性,在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头,同时实验操作时,需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行。Р五:实验操作РRNA抽提?样品处理?贴壁细胞,去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol),反复吹打裂解细胞,再收集TRIzol至离心管中;?(Note:如为悬浮细胞,先离心收集,加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞,如为新鲜组织样品,可取50mg~200mg样品直接在液氮中研磨至粉末,再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中,反复振荡裂解组织细胞)。Р五:实验操作РRNA抽提?相分离?室温放置上述样品液10min左右后,每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL,盖上盖子,剧烈振荡约1min,室温静置5min,然后12000g 冷冻离心15min(4℃),小心取出样品,通过观察可以发现样品分三层,其中最上层含有RNA样品。Р五:实验操作РRNA抽提?RNA沉淀?小心吸取上清液约450μL(每1mLTRIzol 的吸取量)至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中,混匀,12000g 冷冻离心10min(4℃)。
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