构域和不同突变体,应用酵母双杂交、GST-PullDown以及免疫共沉淀的方法确定二者相互作用的结构域,以及作用位点。荧光共定位,免疫组化,蔗糖密度梯度超速离心等方法验证二者在细胞以及肿瘤组织中共定位;磷酸化实验确定E-cadherin是Pyk2的磷酸化底物,以及磷酸化位点。这部分内容从生化的角度确定Pyk2磷酸化E-cadherin的分子机制。2.中间部分:通过细胞迁移实验、裸鼠成瘤转移实验从细胞水平、动物模型确定:Pyk2通过磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制。3.右侧部分:收集肝癌病人标本和临床资料,通过免疫组化、Western等方法检测E-cadherin/Pyk2蛋白水平、磷酸化状态,分析二者表达量的相关性,以及与肝癌转移的相关性。4.最下面部分为汇总数据,总结分析。4.可行性分析1)前期实验已经从酵母双杂交、GST-PullDown、免疫共沉淀等证实了定点突变,GST-pulldown,免疫共沉淀等方法验证确定相互作用的结构域以及位点荧光共定位,免疫组化,蔗糖密度梯度超速离心等方法验证在细胞以及肿瘤组织中共定位收集肝癌病人标本和临床资料免疫组化、Western等方法检测E-cadherin蛋白水平、磷酸化状态和Pyk2表达量的相关性,以及与肝癌转移的相关性。磷酸化实验确定E-cadherin是否是Pyk2的磷酸化底物,以及磷酸化位点细胞迁移实验:测Pyk2蛋白过表达和RNAi抑制时与E-cadherin磷酸化水平、细胞迁移的关系。筛选稳定表达Pyk2肝癌细胞株,检测Pyk2蛋白表达量与E-cadherin磷酸化水平的关系。裸鼠成瘤转移实验:Pyk2蛋白表达量、E-cadherin磷酸化水平与肿瘤转移的关系。汇总分析数据:揭示Pyk2磷酸化E-cadherin机制;揭示Pyk2通过磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制。
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