%低熔点琼脂糖溶液在37℃混匀后,取一半液体滴在第一层的琼脂糖上,盖上盖玻片,4℃,15min.( 第二层越薄越好,使细胞尽量在一个平面?第三层:取下盖玻片,在第二层上滴加60ul0.65%低熔点琼脂糖,4℃,15min。Р步骤2:胶片的制备Р首先制备细胞悬液,然后制片。制片有3种类型:?①“三明治”凝胶:是在磨毛玻璃上铺第一层1%的正常熔点琼脂糖,第二层为细胞悬液与0.5%低熔点琼脂糖混合液(10/1),第三层为0.5%低熔点琼脂糖;?②双层凝胶:不铺上述第三层凝胶;?③单层凝胶:为改善其易与玻片分离的缺点,在玻片上制一凹槽进行单层灌胶。Р裂解:将制好的胶板揭去盖玻片后,侵入4℃预冷的新配制的细胞裂解液中,4℃,2hr(溶解细胞膜及核膜,除去蛋白质、RNA等,仅存核骨架)?解旋:从裂解液中取出载玻片,用电泳缓冲液淋洗 10 S冲去多余盐,晾干后移入水平电泳槽中阳极端,玻片间不留空隙,保证电泳效果。倒入新配置的预冷电泳缓冲液至没过玻片2-3mm,避免出现气泡,4℃避光解旋20min。以便使DNA在碱性条件下解螺旋成单链DNA,使DNA断片在电泳场中易于迁移。?电泳:接通电源,电压25V,电泳300 mA,(低温)避光,电流时间30min。Р步骤3:细胞裂解、解旋和电泳(低温避光)Р中和:将胶板水平放入大平皿中,0.4mol/L Tris(pH 7.4)漂洗3次,每次5min,或缓缓加入Tris缓冲液,将凝胶淹没15min。?染色: 取出胶板,晾干,暗处滴加75ul 20ug/ml EB,盖上盖玻片,染色15min,放置4℃避光保存,24h内镜检。?观察:选择激发波长510-560nm, 滤过波长590nm,视野200* or 400* 倍。每片随机观察50个细胞,并随时拍照记录,用目镜测微尺测量细胞拖尾尾长距离,并用分析软件分析头部与尾部的荧光值。Р步骤4:中和、染色和观察
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