入 HRP 酶保护剂、防腐剂 Proclin300、抗生素(庆Р大)、脱脂奶粉以及免疫助沉剂组成高效的抗体稀释液,从不同的角度最大限度地增强РWestern Blot 检测的灵敏度。Р二、基本操作流程: Р 提取细胞或组织蛋白、测定大致含量Р ↓Р 制备SDS-PAGE胶Р ↓РTel:+86-21-5446 0832 E-mail:master@.cn website:РWestern Blot 操作全攻略 ShineGene Р 蛋白样品变性、电泳Р ↓Р 电泳转膜Р ↓Р 封闭Р ↓Р 一抗Р ↓Р TBST洗涤Р ↓Р HRP标记的二抗Р ↓Р TBST洗涤Р ↓Р ECL试剂作用Р ↓Р X-光片曝光、显影Р ↓Р 结果分析Р Р Р三、详细操作流程Р(一) 蛋白样品制备Р(1) 单层贴壁细胞总蛋白的提取(培养细胞经过简单数数后,大概数量在106左右即可): Р1、倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使Р残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。Р2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的 PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞,Р然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶Р置于冰上。Р3、按 1ml 裂解液加 10 μl PMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶Р时才可与裂解液混合。) Р4、每瓶细胞加 100-400μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培Р养瓶要经常来回摇动。Р5、裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎Р片和裂解液移至1.5ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。) РTel:+86-21-5446 0832 E-mail:master@.cn website:
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