? 二次作用亲和沉淀Р3Р一次作用亲和沉淀Р①初始阶段:将水溶性化合物分子载体偶联上亲和配体,亲和配基与目标蛋白质络合形成沉淀。这与抗原-抗体的沉淀作用相似. 当配基与蛋白质的亲和结合部位的效价比为1时沉淀率最高。?②所得的沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤,除去杂质;?③用一种适当的试剂将目标蛋白质从配基中解离出来。Р原理是双配基或多配基与含有两个以上亲和结合部位的多价蛋白质产生亲和交联,增大为较大的交联网络而沉淀。Р4Р亲和吸附介质Р1、亲和吸附介质:载体+配基?2、常见载体:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃珠、壳聚糖等。?3、配基与待分离的物质之间的亲和力具有较强的特异性。?4、配基能够与载体稳定的共价结合,且不易脱落。Р5Р配基的选择Р配基:可与目标蛋白特异性结合。Р6Р间隔臂Р1、当配基的相对分子质量较小时,将其直接固定在载体上,会由于载体的空间位阻,配基不能对生物大分子产生有效的亲和吸附作用。?2、因此,需要在配基与载体之间连接一个“间隔臂”,以增大配基与载体之间的距离,使其与生物大分子发生有效的亲和结合。Р7Р目标蛋白与配基亲和作用机理Р1.蛋白质参与亲合作用的机理尚不完全清楚。?2.一般认为,参与亲合作用的两个物质就像钥匙和锁扣的关系一样。?3.除此之外,还需要分子或原子水平的各种相互作用才能完整地体现亲合作用。(如静电作用,氢键等)Р8Р亲和作用力Р1.静电作用:亲合作用分子对的结构部位上带有相反电荷时,产生静电引力。?2.氢键:O…H—O或O…H—N。?3.疏水性相互作用:即两分子中均含有芳香环或烃基链等疏水基,则两者之间可发生疏水性相互作用。?4.配位键:如果两个分子均与同一金属原子配位,则两者之间可通过金属配位键间接结合。?5.弱共价键:结合力较弱的可逆共价键。如醛基和羟基之间形成的半缩醛基。Р9Р一次亲和作用的基本过程Р10
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