目的基因; (2)与克隆载体连接,形成新的重组 DNA 分子; (3)用重组 DNA 分子转化受体细胞,并能在受体细胞中复制和遗传; (4)对转化子筛选和鉴定; (5)对获得外源基因的细胞或生物体通过培养, 获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。?获得需要的目的基因常用的方法: (1 )直接从生物体中提取总 DNA , 构建基因文库(gene library) ,从中调用目的基因; (2)以 mRNA 为模板,反转录合成互补的 DNA 片段; (3 )利用聚合酶链式反应( PCR ) 特异性地扩增所需要的目的基因片段,等等。 11.2 获得需要的目的基因(外源基因) n细胞内总 DNA 的提取分离与基因文库的构建?细胞内总 DNA 的提取分离程序?紫外分光光度计测定 DNA 溶液的纯度和浓度。?基因文库的构建将总 DNA 包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上,便构成了该生物的基因文库。 n反转录人工合成互补 DNA ?构建基因文库获取目的基因存在的问题——费时费事内含子序列?反转录人工合成互补 DNA 方法的优势——获取的 DNA 片段往往是具有特定功能的目的基因 n聚合酶链式反应( PCR ) ?PCR 技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目的基因的技术。?加入 4种物质: (1)作为模板的 DNA 序列; (2)与被分离的目的基因两条链各自 5’端序列相互补的 DNA 引物( 20个左右碱基的短 DNA 单链); (3)TaqDNA 聚合酶; (4)dNTP (dATP , dTTP , dGTP 和dCTP )。 n聚合酶链式反应( PCR ) ?变性、退火、延伸三步曲?变性: 双链 DNA 解链成为单链 DNA ?退火: 部分引物与模板的单链 DNA 的特定互补部位相配对和结合?延伸: 以目的基因为模板,合成互补的新 DNA 链
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