前将相应的溶菌酶加入到Enzymatic lysis buffer中,配置成20mg/ml溶菌酶溶液)重悬菌液,37℃水浴60min,再加入 20mlproteinase K溶液,震荡混匀。56℃水浴30min至细菌完全裂解。 3.3.2加入200 μLBuffer BD,充分颠倒混匀。 3.3.3加入200 μL无水乙醇,充分颠倒混匀。 3.3.4将吸附柱放入收集管中,用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部吸入吸附柱中,静置2min,再12000rpm室温离心1min,倒掉收集管中的废液。 3.3.5将吸附柱放回收集管,加入500 μLPW Solution,10000rpm离心30s倒掉滤液。 3.3.6将吸附柱放回收集管,加入500 μLwash Solution,10000rpm离心30s倒掉滤液。 3.3.7将吸附柱放回收集管,12000rpm室温离心2min,离去残留的wash Solution。 3.3.8取出吸附柱,加入一个新的1.5ml离心管中,加入100 μLCE Buffer静置3min, 12000rpm室温离心2min,收集DNA溶液.提取的DNA -20℃保存。 3.4MecA基因的PCR扩增 3.4.1PCR引物[15]:MccA基因引物由上海生工合成,扩增片段长度533bP。上游引物:5'-AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3' 下游引物:5'-CTGGAACTTGTTGAGCAGAG-3' 3.4.2MecA基因PCR反应体系: 基因组DNA(50ng/ μL)0.5 μL, 上下游引物(10uM)各0.5 μL, Dntp(各2.5mM)1 μL, 10X Buffer(with Mg 2+)2.5 μL, Tap酶(5U/ μL)0.2 μL, 双蒸水加至25 μL。 3.4.3MecA基因PCR循环条件: 万方数据
全文预览
