基因敲除技术研究进展及其在代谢工程上的应用

基于植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)分泌的一种转 录激活子样效应因子(Transcription activator—like effector, TALE)nJ 以识别 DNA 序列的原理。TALE蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核昔酸序列有 恒定的对应关系，由34个氨基酸重复序列组成一个单元，重复17〜18次，34 个氨基酸屮的第12和13个氨基酸(Repeat Variant Di一residue, RVD)对应识别1 个Fl标碱基。。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块 蛋白。TALE蛋白屮的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合，在特异的 位点打断F1标基因，进而在该位点进行DNA操作，如敲入(Knock—in)＞敲出 (Knock—out)或点突变［17］。РTALENs成功解决了常规的ZENs方法不能识别任意Fl标基因序列，以及识 别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有与ZENs相等或更好的活性，无基 因序列、细胞、物种限制，试验设计简单准确，成本低，成功率几乎可达100%, 毒性低，脱靶情况少，使基因操作变得更加简单、方便。Р|?| 2-2 TALENs靶向基因敲除技术结构图РFigure2・2 The structure of TALENsРР2.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技术Р2013 年初，一种全新的人工核酸内切酶 clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR) / CRISPR一associated(Cas)9 出现，主要由细菌和古 细菌通过一种不断进化适应的免疫防御系统改造而成，II型CRISPR/Cas9免疫 系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNAo其特点是制作简单，成本低, 作用高效［18］。