自噬研究方法

含TG浓度为0、0.5、1nM的培养基及含Rapamycin(终浓度1pM)的培养基继续培养24h;弃上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(终浓度50nM)的培养基于37V、h的恒温培养箱中避光温育20min;取出六孔板置于劳光显微镜下,Ih内观察细胞自唾发生情况并拍照。流式细胞术检测细胞自噬发生率(1)取对数生长期的HepG2细胞,接种于6孔板,培养24h之后,分别用含TG浓度为0、1、2、4、8uM的培养基继续培养24h和0.5uM的TG作用不同时间(0、24、36、48、60h)后,取出六孔板,将上清收集到4ml的离心管中;每孔加入2ml含MDC(终浓度50nM)的MEM培养基,于37°C、5%0?的恒温培养箱中避光孵育30min;将收集的上清2000rpm,离心5min;弃掉上清,每管加入500ul含MDC(终浓度50uM)的MEM培养基,吹打混句,37°C避光解育30min;取出六孔板,PBS洗2次,0.25%的胰酶消化2min,1ml的PBS吹打混匀收集到1.5ml的离心管中,2000rpm.离心5min;弃掉上清,加1ml的PBS重悬,2000rpm,离心5min;吸出800ul上清,剩余的200ul吹打混勾;鮮育完的上清,2000rpm,离心5min;弃掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到1.5ml的离心管中,2000rpm,离心5min;重复步骤(6)和(7);将上述两个相同浓度或相同时间点的两管混勾,过300目铜网上机检测。流式细胞仪以488nm激发波长测定MDC染色的荧光强度。LC3BWB:1:2000条件是15%SDS-PAGE,?正常跑胶至下沿0.5cm即可,200mA湿转45min正常0.45的PVDF,5%牛奶封闭1h,4C过夜摇动孵育,洗抗体3*5min即可LC3B的Western-blot检测,配置的15%的分离胶,湿转250mA,60min