待连接的两个DNA片段如果是同一限制性内切核酸酶酶切的,连接后仍保留原限制性内切核酸酶的识别序列。如果用两种同尾酶酶切的,虽然产生相同的互补粘性末端,可以进行有效的连接,但获得的重组DNA分子往往缺少了原来用于酶切的那两种限制性内切核酸酶的识别序列。图2-5互补粘性末端片段之间的链接(2)平末端DNA片段之间的链接链接反应需用T4DNA连接酶。只要两个DNA片段是平齐的,不管是用限制性内切核酸酶酶切产生的,还是其他方法产生的,都可以进行连接(图2-6)。如果在两种不同限制性内切核酸酶酶切后产生的平齐末端DNA片段之间进行连接,连接后的DNA分子失去了那两种限制性内切核酸酶的识别序列。如果两个DNA片段的末端是用同一限制性内切核酸酶酶切产生的,连接后的DNA分子仍保留那种酶的识别序列,有的还出现另一种新的限制性内切酶的识别序列。图2-5平齐末端片段之间的链接三、DNA片段修饰后的链接待连接的两个DNA片段经过不同限制性内切核酸酶酶切后,产生的末端不是互补的粘性末端,或者一个是粘性末端另一个是平末端。在这种情况下,链接之前必须对两个末端或一个末端进行修饰。修饰的方式主要是采用外切核酸酶将粘性末端修饰成平末端;采用末端脱氧核苷酸转移酶(简称末端转移酶)将平末端修饰成互补粘性末端;采用DNA聚合酶将粘性末端修饰成平末端。有时为了避免待连接的两个DNA片段自行连接成环形DNA,或自行连接成二聚体,可采用碱性磷酸酶使其中一个DNA片段5′端-P修饰成-OH,即去磷酸化。4、DNA片段加连杆或接头后连接如果要连接既不具互补粘性末端又不具平末端的两种DNA片段,除了用修饰一种或两种DNA片段末端后进行连接的方法外,还可以采用人工合成连杆或接头。先将连杆连接到待连接的一种或两种DNA片段末端,然后用合适的限制性内切酶酶切连杆,使待连接的两种DNA片段具互补粘性末端,最后在DNA连接酶崔化下使
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