用于无创产前诊断的SRY基因高灵敏高特异检测方法研究

敏度高、不易污染但需较贵的Taqman探针。为此,本研究建立一种基于实时荧光PCR偶联核酸侵入反应的SRY基因检测方法,将基于PCR的模板扩增与基于核酸侵入反应的信号放大技术相结合,具有高灵敏、高特异、低成本、闭管检测不易污染等优点。最终实现对含量低至4‰的模拟样本的检测,并成功检测两例孕期分别为9周和10周的临床实际样本。Р 2 实验部分Р 仪器与试剂Р ene Q实时荧光定量PCR仪; Allegra X30冷冻离心机; Wizard Genomic DNA Purification Kit; QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit; FEN1核酸内切酶; Taq 酶; 3丙磺酸; MgCl2; dNTP; 其它试剂均为分析纯; 实验用水均为灭菌双蒸水。Р 样本收集与处理Р 孕妇EDTA抗凝血样本由南京军区南京总医院提供,取4 mL新鲜外周血以7400 r/min离心10 min, 小心吸取上层血浆置于干净离心管中, 13000 r/min再离心10 min得到血浆样本,按照QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit的操作说明提取血浆游离DNA,置于 30℃保存待用。Р 实验方法Р 实时荧光PCR偶联核酸侵入反应与体系优化反应初始体系 1×反应缓冲液,dNTPs各250 μmol/L,上下游引物各500 nmol/L,侵入探针50 nmol/L, 检测探针250 nmol/L,荧光发夹探针250 nmol/L,Taq酶 U,FEN1酶 U,基因组DNA 1 μL, 用H2O补充到20 μL。反应程序预变性; 10个循环预扩增; 35个循环扩增。在进行反应体系优化时,分别改变Taq酶用量、FEN1酶用量、检测探针浓度及预扩增退火温度,比较各条件下SRY基因扩增的Ct值及荧光信号曲线强度和斜率,选择最优的反应条件。