实验动物 犬腺病毒检测方法

采样后处理Р样品采集结束后，所用到的锐器（如针头）和产生的废物处理按照GB 19489的规定进行。Р6　 PCR检测Р6.1　 引物РP1：5'-CGCGCTGAACATTACTACCTTGTC-3'。РP2：5'-CCTAGAGCACTTCGTGTCCGCTT-3'。Р6.2　 基因组DNA提取Р按照SN/T 4749制备犬样品中的DNA。或者按照商品化的基因组DNA提取试剂盒说明书，提取样品中的基因组DNA。提取的DNA，质量和浓度检测合格后，作为PCR检测反应模板，立即进行检测，或于-20 ℃低温保存。Р6.3　 PCR反应РPCR反应体系：模板1 μL，DNA聚合酶1 μL，P1和P2（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 7 μL。反应条件为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 70 s,35个循环,72 ℃ 10 min。设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为CAV-1病毒培养液或阳性病料,阴性对照为无菌水。Р6.4　 电泳Р反应结束后，取5μL PCR产物与上样缓冲液混合，以醋酸盐缓冲液为电泳缓冲液，于1 %的琼脂糖凝胶中电泳。同时以包含500 bp 和1000 bp大小的适合的DNA分子质量标准物为参照。150 V恒压电泳25 min，紫外灯下观察。Р6.5　 结果判定Р6.5.1　 对照检测结果应成立。Р6.5.2　 被检样品仅在1030 bp处出现条带，判定被检样品中含有CAV-2核酸。Р6.5.3　 被检样品同时在508 bp和1030 bp处各出现一条条带，判定被检样品中同时含有CAV-1和CAV-2核酸。Р6.5.4　 无条带出现，则判定样品中CAV-1和CAV-2核酸阴性。Р6.5.5　 必要时，对扩增产物进行序列测定验证。Р Р_________________________РРР