溶液10倍,配置成1.0mM的储存液。-20°С避光保存。3.Aβ25-35(终浓度为30uM)4.AP(终浓度为10uM)5其它如培养细胞常用试剂(DMEM高糖、胎牛血清、胰酶等),MTT操作方法:(1)收集细胞:取对数生长期细胞收集细胞并调整细胞浓度至(1~10)×106/mL(2)分别加入Aβ、Aβ+AP(六孔板),培养24小时(3)装载探针:加入终浓度为10uM的DCFH-DA,37°С5%CO2培养箱中静置0.5h,每隔3-5min混匀一下,使探针和细胞充分作用。(4) 用无血清的培养基或温暖的PBS液洗涤细胞3次,去除未进入细胞内的DCFH-DA。(5) 收获各组细胞,上流失细胞仪检测ROS。激发光488nm,发射光 525nm(6) 实验分四组:PC-12(空白对照组)、PC-12+DCFH-DA(探针对照组)、PC-12+DCFH-DA+Aβ25-35(实验组)、PC-12+DCFH-DA+Aβ25-35+AP(给药组)结果分析:注意事项:(1)处理过程绝对避光(紫外灯能不能开?)(2)染料与细胞混合时间要充分(3)探针装载后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高(4)尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外),以减少各种可能的误差(5)细胞应保持良好的活性状态。贴壁细胞培养时不应超过瓶底面积的75%,悬浮细胞培养时其数目不能超过5×105/mL;贴壁细胞在消化处理时要尽量温和、快速,避免产生过多的细胞碎片(6)使用流式细胞仪要确保侧面的细胞分散开(在与染料混合和处理时)(7) 流式细胞仪对细胞数目有一定的要求,一般为106,可以使用六孔板(8) 虽然一般要求将阴性对照组细胞调节电压至阴性置信区,但如果正常对照细胞DCFH染色较强、锋行太偏右,可适当降低电压,将锋行调节至中间,以便观察药物的抑制或促进作用(9) 测荧光最好不用塑料管
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