化物酶20~50 µl(试剂盒中的C液,根据组织块大小进行调整),湿盒内28℃放置5~20 min,甩干。Р②置PBS缓冲液的玻璃缸中,缓慢振荡清洗5 min,更换PBS缓冲液,同法操作3次,甩干。Р③滴加新鲜配制的DAB工作液100 µl(以覆盖组织为宜),放置观察反应部位呈现黄褐色时(3~5 min),置装有自来水玻璃缸中涮洗3次;Р6. 复染Р浸入苏木精溶液中复染,放置5 min后,用自来水反复涮洗至水不变色,再用1%盐酸酒精分化1—2 s后,自来水冲洗后,反蓝水洗2 min。Р7. 脱水、透明和封片Р①依次放入95%、95%乙醇溶液的玻璃缸中,每缸浸泡5 min,取出;Р②依次放入2个无水乙醇的玻璃缸中,每缸浸泡5 min,取出。Р③依次放入2个装有二甲苯的玻璃缸中,每缸浸泡5 min,取出。Р④滴加适量中性树胶,封片,晾干。Р8. 注意事项Р①整个染色过程中组织块要保持湿润,不能干片,否则会导致非特异性染色。Р②组织切片边缘易干,因此抗体、封闭液、显色液等试剂要充分覆盖组织块,避免干片。Р四、结果判定Р1. 阳性细胞判断РDAB显色呈黄色。每批染色都要有特异性阳性和阴性对照为基础,才能对染色结果作出判断。抗原表达必须在特定部位,对于临床诊断来说,不在抗原所在部位的阳性着色,一概不能视为阳性。尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的着色多系内源干扰或人为因素所致,不能视为阳性。Р抗原表达评价Р免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标,实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量,我们常用的免疫组化评分方法如下:Р细胞染色强度评分:0(无染色),1(弱染色),2(中染色),3(强染色)Р肿瘤细胞阳性率评分:0(0~9%),1(10%~25%),2(26%~50%),3(51%~75%),4(76%~100%)Р将染色强度评分和阳性细胞率评分的乘积作为该切片评分值。
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