项目小鼠肝细胞Mob1a敲降后MEN通路基因的表达差异研究

作为实验工具转染肝细胞、研究其在体外对肝细胞分裂和活力的影响,为肝脏疾病的基因治疗提供了新的思路和方法,这在国内外尚未见报道。Р本项目首先在哺乳动物肝细胞中特异性敲降Mob1a基因,并率先用荧光定量PCR技术检测MEN通路基因在Mob1a基因沉默背景下的表达水平。Р本项目的成功还具有一定的产业化前景,开发出Mob1a-shRNA真核表达载体,具有自主知识产权,有望达到国际先进、国内领先的水平。Р本项目的成功实施,也为其他动物或组织的有丝分裂及肿瘤发生的研究及治疗提供了先进的科研方法学基础。Р二、项目考核指标Р〔包括①主要技术指标:如形成的专利、新技术、新产品、新装置、论文专著等数量、指标及其水平等;②主要经济指标:如技术及产品应用所形成的市场规模、效益等;③项目实施中形成的示范基地、中试线、生产线及其规模等;④其它应考核的指标〕Р本课题以Mob1a基因作为肝细胞的有丝分裂及增值分裂和肿瘤发生的靶基因,并对下一步研究应用通过控制有丝分裂推出途径进行肿瘤和肝癌的基因治疗奠定了实验基础。本项目的成功实施,也为其他组织的有丝分裂研究提供了先进的科研方法学基础。通过创新性的设计合成靶向基因的外源特异性shRNA序列,定向克隆到相关载体上,构建靶向Mob1a基因的shRNA的真核表达载体。采用脂质体转染法将该重组质粒转染至原代培养的小鼠肝细胞中。同样方法设计空白转染质粒以及非特异序列转染质粒作为对照。通过倒置荧光显微镜观察肝细胞EGFP的表达,以评估质粒转染效率。分别利用实时荧光定量PCR、Western blot分析测定Mob1a mRNA、以及MOB1A蛋白的表达量的改变,以验证shRNA特异性抑制Mob1a基因的效果。MTT法检测转染后对肝细胞增殖的影响。荧光定量PCR分析MEN通路基因的表达。本项目的成功实施将为进一步应用Mob1a基因在哺乳动物肝脏中研究MEN奠定了实验基础。