附到载玻片上;Р③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛(见备注2)中固定25min;Р④PBS浸洗二次,每次5min;Р⑤将吸附细胞的载玻片在0.2%的Triton X-100(见备注5)中处理5min;Р⑥PBS浸洗二次,每次5min;Р后续操作如同石蜡包埋切片的6—15Р四、注意事项Р1. 进行PBS 清洗时,每次清洗5 min。Р2. PBS清洗后,为了各种反应的有效进行,请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。Р3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后,请盖上盖玻片或保鲜膜,或在湿盒中进行,这样可以使反应液均匀分布于样本整体,又可以防止反应液干燥造成实验失败。Р4. TUNEL反应液临用前配制,短时间在冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导酶活性的失活。Р5. 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色,则不可使用,需重新配制。Р6. 用甲基绿(Methyl Green)染液(3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0)染色后,请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净(100%乙醇)、脱水(二甲苯)透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时,甲基绿比较容易脱色,注意快速进行脱水操作。Р7. 荧光素标记的dUTP液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物,可通过吸入、口服等途径进入机体,注意防护。Р8. 试剂保存;未打开的试剂盒贮存在-20℃(-15~25℃);converter -POD液一旦解冻,以后就保存在4℃(2~8℃)下,至少在6 m内稳定,避免再次冻存;TUNEL反应液临用前配好后,放至冰上直至使用。Р9. 结果分析时注意:在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断,从而引起假阳性结果;而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全,以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应,进而产生假阴性结果。
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