5.5之间,作用之前应该用氢氧化铵调节,使其PH为7。用固体硫酸铵盐析时,蛋白质应溶解于具有一定缓冲能力的溶液中,并且在加入硫酸铵中还含有一些重金属离子,用量大时易使蛋白质变性,在这种情况下可加入一些EDTA等螯合剂以螯合这些金属离子。Р硫酸铵盐析法可使蛋白质的纯度提高约5倍,而且可以除去DNA,RNA等。但盐析后的蛋白质中仍含有一些杂蛋白,所以盐析产生的产品为粗分离产品需要进一步纯化。本实验中利用离子交换层析法纯化。在离子交换层析之前,由于盐析所得的蛋白质中含有大量硫酸铵,将影响离子交换层析。所以,在层析之前需要“脱盐”。“脱盐”有凝胶过滤法和透析法,本实验将采用凝胶过滤法。Р(二)试剂与器材Р(1)饱和硫酸铵溶液:取化学纯(NH4)2SO4800g,加蒸馏水1000ml,不断搅拌下加热至50~60℃,并保持数分钟,趁热过滤,滤液在室温中过夜,有结晶析出,即达到100%饱和度,作用时用浓NH4OH调至PH7.0。Р(2)0.01mol/L,PH7.0,磷酸盐缓冲溶液:取0.2mol/L Na2HPO4溶液61.0ml,0.2 mol/L Na2HPO4溶液39.0ml,混合,用酸度计检查PH应为7.0。取该混合液50ml,加入7.5gNaCl,用蒸馏水1000ml。Р(3)0.0175mol/L,PH.7,磷酸盐缓冲溶液:取0.2 mol/L Na2HPO4溶液43.5ml与0.2 mol/L Na2HPO4溶液56.5ml相混合,用酸度计检查PH应为6.7。取该混合液87.5ml,用蒸馏水稀释至1000ml。Р(三)操作Р(1)在1支离心管中加入5ml血清和5ml 0.01mol/L,PH7.0 磷酸盐缓冲液,混匀。用皮头滴管吸取饱和硫酸铵溶液,边滴加边搅拌于血浆溶液中,使溶液的最终饱和度为20%(应加入饱和硫酸铵溶液多少毫升?),用滴管边加边搅拌,是为防止饱和硫酸铵1
全文预览
