将此12ml含抗体的琼脂倾注于放在水平台上的塑料板上,待板冷却。此抗体琼脂板的厚度为2mm,琼脂浓度为1.5%。Р2. 稀释参考血清和待测血清;Р(1)稀释参考血清:每支冻干参考血清中加入蒸馏水0.5ml,待完全溶解后,用生理盐水稀释成几个不同稀释度。例如参考血清IgG含量为11.66mg/ml。Р参考血清稀释度1:10 1:16 1:20 1:32 1:40 1:64РIgG相应含量为1166 728 583 364 291 182Р(2)待测血清用生理盐水作1:40稀释。Р3. 打孔用打孔器在琼脂板上打孔,孔径3mm,孔间距15mm,用注射器针头挑出孔中琼脂,不可损坏孔缘。Р4. 加样打孔后立即用微量加样器分别吸取各种稀释度参考血清10ul,准确地加到琼脂板孔中,每种稀释度加二个孔。用同样方法吸取10ul已稀释好的待测血清,每份标本加二个孔。Р5. 反应将加样的琼脂板平放在搪瓷湿盒中,置37反应24~48h。Р结果观察Р取出琼脂板,即可见清晰的乳白色沉淀环。用标尺测其沉淀环直径并记录。Р标准曲线的绘制以所加各种浓度参考血清的沉淀环直径为纵坐标,相应孔中IgG浓度为横坐标,在半对数纸上作图,绘制标准曲线。Р待测标本Ig含量的计算: 以待测标本孔的沉淀环直径查标准曲线,将查得的Ig含量乘以标本的稀释倍数,即得该标本Ig的含量Р注意事项Р1. 该试验为定量试验,因此,对各种影响因素,如参考蛋白的标准、抗体浓度、琼脂的质量与浓度、免疫板的厚度与均匀程度等,必须严格控制。Р2. 制备琼脂板时,温度不宜过高,以免使抗体变性失活,但亦不宜太低,以免使琼脂凝固不均。Р3. 稀释抗血清、参考血清和加样时均需用微量加样器,加样量要准确,且每个样品加两个孔。Р4. 测量沉淀环直径务虚准确,若有误差,再乘以稀释倍数,则误差可成倍的增加。Р5. 标准曲线测定必需同时制作,不可一次作成,长期应用。
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