5ml菌液)。0~4℃,4000 rpm离心10min。倒出上清培养液,并将离心管倒置在滤纸片上1min,使残留的培养液流尽。(注:要将LB液去尽,否则会影响感受态效果,但又不能让细胞回温。可用吸水纸吸尽管口附近的LB液,再用无菌棉签小心擦出管内残液,整个过程要迅速。)Р 4. 用5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2轻轻悬浮细胞(将加样枪设定在500μl,轻吹细胞,有的书说:轻轻旋转,切勿剧烈振荡或以移液枪头吹打,约需2min),冰上放置15~30min(这步非常重要)。Р 5. 0~4℃,4000 rpm离心10min,弃去上清,加入1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液,小心悬浮细胞,冰上放置片刻后即制成了感受态细胞悬液。Р 6. 以上制备好的感受态细胞悬液可在冰上放置,24h内直接用于转化实验,也可加入等体积的30%灭菌甘油,混匀后,分装于0.5ml EP管中,每管含100 μl感受态细胞悬液,置于-70℃下保存半年至一年。Р 7. 取100 μl摇匀后的感受态细胞悬液(如果是冷冻保存液,则需化冻后马上进行下面的操作),加入质粒DNA溶液2 μl(含量不超过50 ng,体积不超过10 μl)。Р 8. 轻轻摇匀后,冰上放置30 min后,于42℃水浴中保温90 s(期间要不断摇晃管子),然后迅速在冰上冷却3~5min。Р 9. 向EP管内加入100 μl LB液体培养基,则总体积为0.2 ml。混匀,于37℃水浴中温浴45min(欲获得更高的转化率,此步也可温和摇动培养),使受体菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。Р 10. 将适当体积(每个90mm的平板最多200 μl,一般加100 μl)转化后的感受态细胞均匀涂布到含相应抗生素的LB平板上。将平板置于室温直至液体被吸收。Р 11. 倒置平板,37℃培养。12~16 h后即可长出转化克隆。
全文预览
