HRMР_____一种用于突变扫描和基因分型的遗传学分析方法Р高分辨率熔解曲线(high resolution melting)是在实时荧光PCR基础上发展起来的一种新的实时定量新技术。?常规Real-time PCR利用SYBR Green染料标记DNA双链,但是SYBR Green是一种大分子即不饱和染料,不能保证PCR产物全部的小沟都嵌合上SYBRGreen,并且嵌合到产物中的染料如果在扩增过程中不能及时脱落,还会抑制PCR反应。?HRM采用新型的饱和染料如LC Green, SYTO 9等。不仅没有不饱和染料的缺点,而且更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。Р方法?在PCR反应前将LC Green饱和荧光染料与 PCR反应体系混合,然后将PCR产物直接放入LightScanner、HR-1或Rotor-Gene 6000仪器中,在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性,就是对PCR的扩增子进行加热,温度从50°C逐渐上升到95°C。在此过程中,扩增子逐渐解链。在HRM分析的初期,荧光强度很高,随着温度升高,双链DNA逐渐减少,荧光强度也就下降了。HRM仪器通过照相机,记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图,就生成了熔解曲线。Р原理?HRM是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况。SNP位点碱基不同会使双链DNA的TM值发生变化从而双链DNA在升温过程中先后解开,形成不同的融解曲线形状,荧光染料从局部解链的DNA分子上释放,从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP,而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形,因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。РHRM在分子诊断中的应用Р基因分型?突变扫描?甲基化分析?序列配对
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