体外分离培养扩增。常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心,倾去上层脂肪及上清,获得基质血管层,将其收集到培养瓶中培养,除去未贴壁的红细胞和残渣,剩余的细胞群体称为加工过的脂肪吸取物。原代培养的细胞中贴壁的细胞较少,细胞生长至融合后传代,传代后的细胞称为脂肪干细胞。平均每300mL脂肪组织可获得2×108~6×108 个这样的细胞。? 体外培养条件下,ASC的培养不像BMSC对培养基中胎牛血清的来源和质量有严格要求,DMEM、αMEM、RPMI1640是ASC的常用培养基。一般只添加体积分数为10%的胎牛血清,并且血清无生产批号限制。在传代培养中,平均倍增时间为60h。并表现低水平衰老,1代时细胞没有出现衰老现象,10代时少于5%细胞出现衰老,15代时衰老细胞比例仍低于15%,这表明脂肪ASC体外扩增能力很强,传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。Р脂肪干细胞成脂分化РASC在特定促进因素下可分化为脂肪细胞,长期培养仍可维持此种分化能力。?脂肪细胞分化过程大致如下:?(1)脂肪干细胞向脂肪细胞定向分化,形成脂肪母细胞(一种尚未出现脂滴的梭形细胞);(2)脂肪母细胞经过生长抑制、克隆性增殖,形成前体脂肪细胞(此时细胞刚开始出现脂滴);(3)前体脂肪细胞经过生长抑制、克隆性增殖和一系列基因表达的变化,形成不成熟脂肪细胞或多室脂肪细胞(内含大量小脂滴);(4)多室脂肪细胞随着脂肪在细胞中的沉积,小脂滴逐渐汇集成一个大脂滴充满脂肪细胞的大部分,形成成熟脂肪细胞或单室脂肪细胞,成为成熟的脂肪细胞。?目前普遍认为脂肪母细胞是脂肪干细胞接受相关刺激,如寒冷、激素、生物活性因子、体外实验性诱导剂刺激后,由多能变为单能定向分化的起始阶段。?前脂肪细胞的增殖与分化的关系为:生长停顿—生长再续—细胞分化。其中生长停顿是必要的第一步,由单层细胞形成产生的接触抑制或是药物的作用、营养因子缺乏引起。
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