5min), 甩去 PBS 液,然后在每张玻片上滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)工作液, 放入 37℃恒温箱内孵育 10min,用 PBS 液漂洗 3 次(每次 5min);Р⑦、甩去 PBS 液,应用 DAB 显色试剂盒,在每张玻片滴加 DAB 显色剂溶液 50~100ul,在室温下进行显色(约 5min),光学显微镜下掌握染色程度,镜下观察,显色满意即可;Р⑧、苏木素复染 2min→依次在(85%、95%、100%)乙醇溶液各脱水 5min→Р二甲苯透明 10min→中性树胶封片,置于室温内晾干后进行镜检。备注:采用试剂公司附赠的阳性片作为阳性对照,采用 PBS 代替一抗进行Р试验,染色结果作为阴性对照。Р2.4 结果判断Р在显微镜下观察到细胞核和(或)细胞浆被染色成棕黄色的细胞为阳性细胞, 在高倍视野下观察应不少于 5 个视野,将每个视野染色细胞所占百分比分为 5 个级别,阳性细胞表达百分率:≤10%为 0 分,1 分为 10%-25%,2 分为 25%-50%,Р3 分为 50%-75%,4 分为>75%,依据染色程度强弱不同可分四级:0 分、1 分、2 分和 3 分分别代表细胞核和(或)细胞浆无染色、淡棕色、棕色、深棕色,根据“染色细胞所占百分比×染色程度”对实验结果进行评分:阴性(-):0-2 分; 弱阳性(+):3-5 分;阳性(++):6-8 分;强阳性(+++):9-12 分,分别计算三组 PrPC 阳性率,所有结果由本院两位高年资病理医师采用上述标准进行评分。Р2.5 统计学分析Р采用 SPSS19.0 统计软件分析实验数据,癌旁正常直肠、直肠腺瘤及直肠癌之间 PrPC 表达率相互比较采用χ2 检验,PrPC 表达强度与癌症患者临床病理参数之间的相关性应用 Spearman 等级相关分析,检验水准取α=0.05,P<0.05 认为有统计学意义。
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