法分离纯化得到细菌菌株142株。以大肠杆菌、黑曲霉、禾谷镰刀菌等为指示菌,采用滤纸片法或平板对峙法从142株细菌菌株中初步筛选得到具有广谱抑菌效果的菌株7株,其中菌株LM2303广谱抑菌效果最好。通过形态特征分析、生理生化特性分析和16SrDNA序列比对,菌株LM2303应为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。采用紫外线诱变、硫酸二乙酯诱变和微波诱变对菌株LM2303进行选育。其中,经硫酸二乙酯诱变处理得到突变菌株D59,其抑菌效果较原始菌株提高了11.4%。以抑菌物质产量为指标,从8种基础培养基中筛选出菌株D59最佳发酵培养基M2。采用单因素实验和响应面分析对菌株D59进行发酵条件优化。单因素试验结果表明培养时间、温度和转速对菌株D59抑菌物质产量有显著影响(p<0.05)。利用响应面确定菌株D59的最佳培养条件为:接种量5%、装液量100mL/250mL、培养时间43h、温度33℃、转速177rpm。在上述发酵条件下培养,100mL发酵液可得到抑菌物质粗提物2.8560g(湿重),是原发酵条件下的1.4倍,有效提高了抑菌物质产量。采用盐酸沉淀、甲醇萃取,从拮抗菌株发酵液中得到抑菌物质粗提物。利用薄层色谱对抑菌物质进行分析和初步纯化,紫外及茚三酮显色结果表明抑菌物质含有苯环和闭合肽键。红外光谱扫描结果表明菌株LM2303抑菌物质为环状脂肽类物质。该脂肽类物质理化性质稳定,抑菌谱广,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌和黑曲霉、黄曲霉、扩展青霉、禾谷镰刀菌等真菌均有较强的抑制作用。从不同腐烂病症的冬枣上分离得到根菌索菌、细极链格孢、橄榄色盾壳霉、扩展青霉四种致腐真菌。平板对峙试验结果表明菌株LM2303可有效抑制上述四种真菌的生长,菌株LM2303具有冬枣贮藏期致腐真菌的生物防控应用潜力。?…………………关键词:枯草芽孢杆菌;拮抗;抑菌物质;诱变选育;发酵条件优化
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