NA提取与PCR扩增:配制LB液体培养基100ml,取16个试管,将有反硝化能力的8株菌株接种到试管中,进行好氧培养,16小时后放4℃保存。使用煮菌法从平板A上提取DNA,把已知的反硝化基因nirS和nosZ基因为目的基因,使用相应引物,进行PCR扩增,电泳后比对。通过研究比对看具有反硝化能力的菌是否含有这两种基因。取4℃保存的菌液使用Bead-beater法提取高纯度DNA。用此DNA作为扩增16SrDNA的模板,引物为16SrDNA全程引物(27F、1492)。同时使用此DNA对目的基因PCR作复核,重复三次实验。琼脂糖凝胶电泳(8个菌株的DNA样品+阳性对照+阴性对照)使用30ml规格0.8%的琼脂糖-TAEbuffer溶液,取全基因组DNA样品3μl,无菌水2μl,缓冲液1μl在塑料膜上点样混匀后注入凝胶的孔内,电压80V。使用50ml规格的琼脂糖-TAEbuffer溶液,取PCR扩增DNA样品3μl,无菌水2μl,缓冲液1μl在塑料膜上点样混匀后注入凝胶的孔内,电压120V。结束后放入暗箱内拍照,比对。16SrDNA电泳产物的割胶回收制备回收胶,紫外灯下割取明亮条带于1.5mlEp管中。使用OMEGA公司的DNA回收试剂盒回收16SrDNA。使用OMEGA公司的DNA回收试剂盒回收16SrDNA称胶重加适量Bindingbuffer(XP2)放入60℃水浴10min使胶融化。组装DNAcolumn和2ml收集管加入700μl样品,1000×g离心1min倒去液体加700μlBindingbuffer(XP2)重复一次1000×g离心1min最大转速空转2min,放65℃烘箱5min加DNA洗脱缓冲液50μl,1000×g离心1min化学转化取感受态大肠杆菌细胞(DH10B),放冰上融化。配制10μl体系(T载体0.5μl,solutionI5μl,样品4.5μl)
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