电泳,胶内酶切和提取肽后进行液相色谱.串联质谱分析,在质谱鉴定过程中并不考虑糖肽而只按照常规方法进行数据库检索,最终得到51个蛋白质的鉴定。对于N型糖蛋白/糖肽来说,如果结合非特异性糖苷酶PNGaseF可从N型糖链与天冬酰胺相连的D.1,4糖苷键处切断糖链,同时将天冬酰胺转化为天冬氨酸,分子质量发生1Da的变化,利用质谱可以检测糖基化位点并鉴定糖蛋白。这个方法已经在糖蛋白质组学中普遍使用,结合不同的富集方法,利用质谱可以鉴定到成百上千个糖基化位点和对应的糖蛋白[24,25】,使高通量分析成为可能。此外还可以使用内切.p.N.乙酰葡糖胺酶H(endo?bNacetylglucosaminidaseH,EndoH)将N.Ac以外的部分切除,Ac,从而起到标记糖基化位点的作用[26,27]。对于0型糖蛋白/糖肽来说,由于缺乏广谱的去除O型糖链的糖苷酶,因此酶解法无法实现对全部O型糖基化肽及位点的鉴定。由于0型糖链结合于Ser和Thr上,可以应用D一消除反应将糖链去除以鉴定糖肽。(2)糖链结构的分析糖蛋白中的糖链形式各异、连接方式多样,传统的方法是将其进行氧化还原反应,再逐个分析。目前应用生物质谱的方法,大大改善了分析进程,通常以蛋白酶切、HPLC分离得到含糖肽段,对含糖肽段可以直接通过质谱断裂得到单糖碎片,从而确定糖链结构;也可用糖苷外切酶从糖链外端对糖链进行逐一切除并做质谱测定,不仅可以确定其连接方式,由所应用的糖苷外切酶的高度特异性,还可以判断糖链的立体结构。Wuhrer等利用MALDI.TOF精确分析了HRP糖蛋白8个糖基化位点糖链的结构[28】。Schmia等利用糖苷外切酶以ESI质谱分析了人乙肝病毒M表面蛋白中pre.32区域的N、O.链接糖链结构[291。但利用质谱技术进行糖链结构解析需要的样品量比较大,对于复杂的生物样品较难获得足够的高纯度糖蛋白进行糖链结构的分析。
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