入无离子水或蒸馏水定容到1000ml。(三)作步骤样品中蛋白质浓度的测定:考马斯亮蓝G250l00μl,样品20μl,对照用Tris-HCl20μl。再用制作标准曲线的方法对样品进行测定,测定的0D595值结果由标准曲线求出样品的蛋白质浓度。二、PPO活性测定(一)原理与方法PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物,在0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中,PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌,在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化,通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。其方法是:在含有4mlPH5.8的O.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05m10.05M邻苯二酚溶液,在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液,反应5分钟,在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下,以A410读数,以每分钟增加0.01OD值定义为一个酶活性单位(U)。(二)仪器与试剂(1)样品:凝胶色谱DE-52层析纯化洗脱组分;葡聚糖凝胶洗脱组分(2)底物:邻苯二酚;0.01M邻苯二酚溶液(3)反应体系:O.2M邻酸二氢钠-0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8(4)器皿与仪器:试管、恒温水浴等,分光光度计(三)实验步骤样品中蛋白质活性的测定:柠檬酸缓冲液(buffer)20μl,底物邻苯二酚20ul样品20μl,对照用Tris-HCl20μl。在分光光度计410nm下测定酶活。(四)实验结果:凝胶色谱层析纯化后PPO酶蛋白质含量和活性的测定样品活性活性CK(1)0.000.00粗酶(2)0.5050.08130.5310.07540.3611.74050.2960.52760.2280.16370.1780.07080.1560.14090.140.077100.0400.079110.0690.047实验七:亲和层析纯化胰酶
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