(3)脱色和保存:考马斯亮蓝R-250染色后的凝胶,用水冲去表面染料,放入脱色液中浸泡,经常更换脱色液直到背景几乎无色为止,大约第二天即可显出蛋白条带。凝胶可在7%醋酸中长期保存。Р 五、结果处理Р (1)计算迁移率:测量由凝胶柱顶端至溴酚蓝和蛋白质色带的距离(cm),按下式计算相对迁移率(Rf)。Р Rf=蛋白质移动距离(cm)/溴酚蓝移动距离(cm)Р (2)作图:当蛋白质相对分子质量在12000~200000时,电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性相关关系。lgMw=-bRf+K式中,Mw为分子质量,Rf为相对迁移率,b为斜率,KР 为常数。Р 以标准蛋白质相对分子量的对数为纵坐标,以相对迁移率为横坐标作标准曲线。根据样品蛋白质的相对迁移率可从标准曲线上查出其相对分子质量的对数,然后再换算成样品蛋白质的相对分子质量。Р 实验结果:Р (1)标准品细胞色素C(CytC)相对迁移率=Rf1=3.1/6=0.52Р 牛血清白蛋白(BSA)相对迁移率=Rf2=1.2/5=0.24Р 碱性磷酸酶相对迁移率=Rf3=1/5.8=0.17Р 六、讨论Р (1)制胶时注意不能产生气泡,加水覆盖勿扰动胶面。Р (2)Acr和Bis的原液会由于水解作用而形成丙烯酸和NH3。若将溶液装在棕色瓶中于4℃冰箱储存能部分防止水解,但也只能储存1~2个月。可用测pH的方法来检查是否失效。失效溶液不能聚合。Р (3)Acr和BisР 是神经性毒剂,对皮肤有刺激作用。操作时必须带医用手套,避免与皮肤Р 接触。Р (4)四甲基乙二胺( TEMED)应密封避光保存。Р (5)采用SDS-凝胶电泳法测定分子质量时,每次测定样品必须同时作标准曲线,不得利用另一次点用的标准曲线。Р (6)因SDS可吸附考马斯亮蓝染料,染色前先用脱色液浸泡凝胶条以洗去SDS,可使染色及脱色时间缩短,并使蛋白条带染色而背景不染色。
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